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本制品是探针法2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。采用的抗体法热启动SpecDNA聚合酶(货号：10113ES)可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。同时，配方优化了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适合低浓度模板的扩增，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的标准曲线。

• 按下表加入各成分配制qPCR反应体系：
  

  成分	20μL反应体系	50μL反应体系	终浓度
  2×Hiper Spec Probe qPCR Mix	10μL	25μL	1×
  Forward Primer(10μM)	0.4μL	1μL	0.2μM
  Reverse Primer(10μM)	0.4μL	1μL	0.2μM
  TaqMan Probe(10μM)	0.2μL	0.5μL	0.1μM
  50×Rox	0.4μL	1μL	1×
  模板DNA	X	X	-
  无菌超纯水	至20μL	至50μL	-

  • 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
    
  • 参比染料：Rox的添加，可根据不同仪器型号进行选择，具体可参考“适用机型”。
    
  • 引物浓度：通常引物终浓度为0.2μM，也可以根据情况在0.1～1.0μM之间进行调整。
    
  • 探针浓度：探针终浓度在50 nM～250 nM之间。
    
  • 模板浓度：如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
    
  • 模板稀释：cDNA原液建议5～10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20～30个循环为好。
    
  • 反应体系：推荐使用20μL或50μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
    
  • 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
• Probe qPCR扩增程序：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	95℃	1min	1
  变性	95℃	10sec	40
  退火/延伸	60℃	30sec

  • 预变性时间：根据不同模板和引物的具体情况可适当增加预变性时间至3～5min。
    
  • 退火温度和时间：建议在56～64℃范围内调整。如果反应效果不好，可以适当延长反应时间。
    
  • 荧光信号采集：请参考仪器设置。

• 定量实验至少需要三个生物学重复。
  
• 反应结束后需要确认扩增曲线。进行PCR定量时，需要制作标准曲线。
  
• 反应特异性需要琼脂糖凝胶电泳确认。

• 推荐引物长度25bp左右。扩增产物长度150bp为佳，不要低于100bp，可以在100bp～300bp内选择。
  
• 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。
  
• 引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。
  
• 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
  
• 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

• 探针长度一般为18～40bp。探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但不能与之有重合区域。
  
• 探针的退火温度应为65～67℃。
  
• 引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基。探针5’端应避免使用碱基G。
  
• 若序列中包含多态性位点，应使其位于探针序列中间。

• High Rox适用机型：ABI 5700,7000,7300,7700,7900HT Fast,StepOne,StepOne Plus;
  
• Low Rox适用机型：ABI 7500,7500 Fast,ViiA7,QuantStudio 3 and 5,QuantStudio6,7,12k Flex;Stratagene MX3000P,MX3005P,MX4000P;
  
• 不需要Rox校正的仪器型号：
  Bio-Rad CFX96,CFX384,iCycler iQ,iQ5,MyiQ,MiniOpticon,Opticon,Opticon 2,Chromo4;
  Eppendorf Mastercycler ep realplex,realplex 2 s;
  Qiagen Corbett Rotor-Gene Q,Rotor-Gene 3000,Rotor-Gene 6000;
  Roche Applied Science LightCycler 480,LightCycler 2.0;Lightcycler 96;
  Thermo Scientific PikoReal Cycler;
  Cepheid SmartCycler;Illumina Eco qPCR.